Stimulée par l'évolution des microscopes automatisés fiables et abordables, la dernière décennie a été marquée par une montée en puissance des essais de criblage cellulaire automatisés. La richesse des avantages offerts par l'automatisation des essais de criblage de cellules vivantes est évidente. La production de données de haute qualité et reproductibles à des nombres statistiquement pertinents permet d'obtenir des résultats expérimentaux solides, tandis que le personnel de laboratoire est libéré du fardeau des étapes manuelles répétitives et peut se consacrer à des tâches plus dynamiques. En améliorant la qualité et l'efficacité des laboratoires, l'automatisation est une force motrice derrière les découvertes scientifiques - et c'est une solution populaire pour les applications de criblage cellulaire dans les biotechs et les universités.
L'automatisation des flux de travail d'imagerie peut être aussi simple que le passage d'un lot de plaques d'échantillons dans l'imageur pour des essais à point final fixe, jusqu'à des essais cinétiques plus complexes à lots multiples et à lectures multiples, avec une programmation pour générer des données sur plusieurs points temporels et échantillons. L'amélioration de la précision, de la reproductibilité et du débit à toutes les étapes du flux de travail d'imagerie est le plus grand défi de la microscopie automatisée. Souvent, les données ne sont révélées qu'à l'issue de plusieurs séries d'expériences ou d'essais complexes. L'automatisation et la parallélisation de l'imagerie peuvent être le seul moyen d'y parvenir. L'observation de spécimens vivants dans différents formats de supports d'échantillons pendant plusieurs jours ou l'imagerie de nombreuses plaques multipuits est une tâche exigeante et chronophage pour le microscope comme pour son utilisateur.
L'intégration de solutions robotiques pour la manipulation d'échantillons dans un système d'imagerie peut accroître le degré d'automatisation et, partant, le rendement. Carl Zeiss, l'un des principaux fabricants de microscopes au monde, s'est associé à Peak Analysis and Automation (PAA), l'un des principaux fabricants de robots et fournisseurs de solutions automatisées, pour proposer une offre répondant à l'évolution de la demande de la communauté des chercheurs en matière de solutions d'imagerie à haut débit.
ZEISS Celldiscoverer 7 - une plateforme d'imagerie cellulaire entièrement automatisée
ZEISS Celldiscoverer 7 - un système automatisé d'imagerie de cellules vivantes conçu pour simplifier la microscopie complexe - abrite de multiples fonctions d'automatisation telles que la reconnaissance automatique de l'échantillon, la mesure du matériau du fond du porte-échantillon et de l'épaisseur du fond pour adapter automatiquement le système à des conditions d'imagerie optimales, une routine d'étalonnage automatique pour les microplaques, un objectif à immersion automatique dans l'eau, une variété d'options d'autofocus ainsi que l'acquisition et le traitement automatisés d'images, pour n'en citer que quelques-unes. Toutes ces caractéristiques ont été réunies dans cette machine pour permettre l'exécution facile et reproductible d'expériences sophistiquées.
L'instrument permet l'imagerie de plusieurs types de supports d'échantillons, y compris des plaques multi-puits, des plats, des lames de chambre, etc., ce qui donne la liberté d'imager divers types d'échantillons de cellules fixes ou vivantes, de tissus, d'organoïdes, de sphéroïdes et d'organismes modèles de petite taille. Les conditions environnementales telles que les niveaux de CO2, d'O2 et la température sont donc étroitement contrôlées.
Le ZEISS Celldiscoverer 7 est doté d'un concept optique unique : 4 lentilles frontales combinées à des changeurs de grossissement 3× permettent d'obtenir 12 grossissements (de 2,5× à 100×), adaptés à une grande variété d'applications. Trois de ces grossissements (25×, 50×, 100× ; NA 1.2) sont dotés d'une fonction d'auto-immersion qui fournit et retire l'eau de manière entièrement automatique.
Deux variantes sont disponibles : une configuration à champ large avec différentes options de caméras haut de gamme et un système combiné comprenant le LSM 900 pour la coupe optique confocale en 3D. Pour accélérer l'acquisition des données, les images de la caméra et les images confocales peuvent être acquises au cours d'une même expérience et superposées avec précision grâce à l'acquisition unique en mode mixte.
Le système LSM est doté de la technologie clé de ZEISS - le détecteur Airyscan 2, qui offre un rapport signal/bruit exceptionnel et une option de balayage rapide, ce qui permet une imagerie rapide et douce des cellules vivantes. En outre, le LSM permet de réaliser des expériences avancées de photomanipulation et d'imagerie spectrale.
spectrale sont possibles à l'aide du LSM.
Ainsi, le Celldiscoverer 7 est un appareil d'imagerie de cellules vivantes entièrement automatisé et flexible qui offre des possibilités d'imagerie multimodale pour une plus grande souplesse d'application. Solutions automatisées PAA pour le chargement des échantillons.
Solutions automatisées d'AAP pour le chargement des échantillons
La solution automatisée PAA fournit une manipulation automatisée des échantillons pour les essais par lots à point final fixe et les essais cinétiques avec un incubateur pour permettre des points d'incubation/lecture multiples et des lots multiples à exécuter en utilisant l'interface logicielle innovante Assay Manager. La configuration globale permet de personnaliser l'appareil en fonction des besoins de l'application en intégrant du matériel supplémentaire (par exemple, un lecteur de code-barres, la manipulation de liquides). Ainsi, deux principaux types d'applications sont proposés en standard.
Essais à point final fixe
Ce processus utilise les piles séquentielles PAA pour permettre à un opérateur d'ajouter un lot de plaques à traiter avec le ZEISS Celldiscoverer 7. Les piles sont reliées à la paillasse à l'aide d'une base POD PAA " click and connect " pour faciliter le chargement et le déchargement des piles par l'opérateur, afin de fournir un système facile à charger et à utiliser.
Essais cinétiques
PAA propose également un incubateur intégré qui peut être utilisé pour les étapes d'incubation à lectures multiples. L'incubateur standard peut accueillir 42 plaques multi-puits standard et peut contrôler la température et la concentration en CO2 pour maintenir les cellules dans des conditions optimales.
et la concentration de CO2 pour maintenir les cellules dans des conditions optimales. Les options pour les études sur l'hypoxie peuvent également être appliquées à l'incubateur afin d'imiter les changements physiologiques causés par la maladie et la capacité des cellules à maintenir l'homéostasie cellulaire et tissulaire.
Des incubateurs de plus grande capacité peuvent également être proposés pour des études à plus long terme avec des lots plus importants. L'interface logicielle PAA Assay manager permet de programmer facilement des études multi-lots/multi-lectures et de les planifier de manière transparente sur le système.
Deux variantes pour la manipulation automatisée des échantillons de PAA fonctionnant de manière transparente avec tous les autres composants du système ZEISS Celldis-coverer 7 sont disponibles :
1. Variante d'entrée de gamme S-LAB
2. Variante haut de gamme du KX-2
Chargeur robotisé | Celldiscoverer 7 Widefield | Celldiscoverer 7 + LSM 900 |
S-LAB | + | non |
KX-2 | + | oui |
Intégration du manipulateur de plaques S-LAB avec ZEISS Celldiscoverer 7
Le manipulateur de plaques innovant S-LAB est un manipulateur de plaques peu coûteux qui peut être utilisé pour intégrer la version Widefield du ZEISS Celldiscoverer 7.
Le manipulateur de plaques S-LAB a été conçu pour fournir une solution d'automatisation d'entrée de gamme avec un manipulateur de plaques compact qui a la fiabilité et la robustesse d'un bras robotisé. Le S-LAB peut manipuler des microplaques avec ou sans couvercle et est fourni avec une station de désoperculation et un lecteur de code-barres. Le S-LAB dispose d'une détection optique de la plaque pour un fonctionnement fiable sans surveillance, et un temps de chargement de la plaque aussi rapide que 16 secondes avec un temps de cycle complet de 32 secondes pour un transfert d'échantillon rapide et fiable.
Le S-Lab peut être fourni avec des piles pour fournir une capacité allant jusqu'à 100 microplaques standard (sans couvercle) / 80 avec couvercle pour les essais à point final fixe. Il est également compatible avec un incubateur automatisé pour les essais cinétiques, comme le montre l'image ci-dessus.
Figure 2 : Installation du robot KX-2, du Celldiscoverer 7 et de l'incubateur sur le site d'un client
Intégration du robot KX-2 avec ZEISS Celldiscoverer 7
Le cœur du système est le robot de laboratoire collaboratif KX-2 de PAA, qui offre une spécification de premier ordre pour permettre une intégration rapide et facile du ZEISS Celldiscoverer 7.
Le robot KX-2 peut être utilisé en toute sécurité sur un banc ouvert, avec une protection totale de l'opérateur, et il est conforme à la norme internationale ISO-TS-15066 sur les robots collaboratifs. Le robot est entraîné
Il est donc facile pour l'opérateur de réapprendre des positions ou d'ajouter de nouveaux articles de laboratoire sans faire appel à un ingénieur en robotique qualifié. Un lecteur de code-barres intégré à la pince améliore la traçabilité des échantillons et accélère le temps de traitement entre les transferts de plaques et l'imageur. La rotation continue à 360° de l'accès principal permet au robot de trouver le meilleur chemin entre les transferts de plaques, sans qu'il soit nécessaire de réinitialiser l'axe.
de trouver la meilleure trajectoire entre les transferts de plaques, sans qu'il soit nécessaire de régler à nouveau l'axe.
Le KX-2 offre une portée radiale de 641 mm, la meilleure de sa catégorie, qui permet d'ajouter à l'avenir des instruments supplémentaires, tels que des manipulateurs de liquides, ainsi qu'une compacité radiale de 183 mm, qui permet d'occuper une grande zone de travail, entièrement accessible au robot, ce qui permet de réduire l'encombrement et d'économiser de l'espace précieux dans le laboratoire.
Gérez votre flux de données avec le logiciel Assay Manager qui fournit une planification contrôlée pour les applications multi-lots, le transfert de données vers des serveurs et les applications LIMS automatiques.
L'interface du logiciel PAA Assay Manager a été développée pour les analyses cinétiques et permet à l'opérateur d'exécuter facilement des lots d'échantillons avec plusieurs lectures et temps d'incubation. La portée d'Assay Manager a été conçue pour permettre le chargement et l'exécution sur le système de plusieurs exécutions par lots de différents opérateurs, les processus demandés étant parfaitement imbriqués par le moteur de planification PAA afin de garantir que les plaques sont lues précisément au bon moment dans le calendrier.
Un processus Assay Manager typique pour un test cinétique avec ZEISS Celldiscoverer 7 pourrait inclure les étapes suivantes :
1. L'opérateur 1 charge le lot initial de plaques d'échantillons à traiter dans l'incubateur.
2. L'opérateur 1 sélectionne les protocoles de lecture (= imagerie), le nombre de lectures et l'intervalle de lecture.
3. L'opérateur 1 démarre ensuite l'exécution.
4. À tout moment, l'opérateur 2 peut charger son lot de plaques dans l'incubateur, sélectionner ses intervalles de lecture et les paramètres de lecture de l'imageur et mettre ses échantillons en file d'attente sur l'interface Assay Manager.
5. Assay Manager programmera le lot d'échantillons à partir de l'opérateur 2 et entrelacera les processus pour garantir que les plaques sont lues au bon moment.
6. L'opérateur 3 peut ensuite charger son lot de plaques qui sera ensuite intercalé dans le planning.
7. Des opérateurs supplémentaires peuvent ajouter des lots d'échantillons supplémentaires à tout moment du processus et tant que la durée des intervalles de lecture est suffisante pour éviter tout conflit, ils seront intercalés dans le processus.
8. Si l'entrelacement des échantillons des opérateurs n'est pas possible en raison d'un conflit de planification, ils en seront informés au moment opportun et une heure de début de leur lot leur sera fournie, ce qui permettra l'entrelacement sans conflit.
9. Une fois le lot de chaque opérateur terminé, l'opérateur sera informé que son analyse est terminée et il lui sera demandé de retirer ses plaques de l'incubateur.
Les informations générées par le processus peuvent être transmises à un système LIMS soit par un transfert de fichier plat dans un dossier partagé, soit par une intégration bidirectionnelle complète qui permettra au système LIMS de transmettre un flux de travail au système et de recevoir les données d'image en retour.
Configuration du système pour la manipulation automatisée des plaques
L'option d'équiper le ZEISS Celldiscoverer 7 d'un chargeur robotisé nécessite une configuration système spéciale. Le Celldiscoverer 7 nécessite une chambre d'échantillon modifiée pour permettre la manipulation de l'échantillon par le chargeur robotisé ainsi que le module ZEN Macro Environment et des macros dédiées.
La solution automatisée de manipulation d'échantillons de PAA comprend les éléments suivants :
• Chargeur de plaques (manipulateur de plaques S-LABTM ou robot KX-2TM)
• Logiciel de contrôle S-RUNTM
• Logiciel Assay Manager (interface utilisateur)
• Lecteur de codes-barres
• Banc du système
• En option : incubateur (par ex. Thermo Fisher Cytomat C2)
• En option : solution de manipulation de liquides
Exemple d'application : Génération automatique de courbes de croissance pour plusieurs plaques
Dans un flux de travail typique utilisant ZEISS Celldiscoverer 7 avec un chargeur robotisé, l'imagerie séquentielle de plusieurs échantillons, tels que des plaques multipuits, est exécutée sur une longue période pouvant aller jusqu'à plusieurs jours.
Cela permet de surveiller par exemple la viabilité cellulaire et de générer automatiquement des courbes de croissance au fil du temps. Toutes les modalités d'imagerie ZEISS Celldiscoverer 7 peuvent être utilisées de manière transparente dans un tel flux de travail automatisé. Dans le diagramme suivant, un tel exemple de flux de travail est présenté de manière schématique.
Dans cet exemple, trois plaques à 96 puits avec des cellules ensemencées à différentes densités ont été imagées sur une période de 15 heures. Les plaques ont été conservées dans des conditions idéales à l'intérieur de l'incubateur et transportées rapidement via le robot KX-2 dans le ZEISS Celldiscoverer 7 incubé et retour une fois par heure.
L'imagerie a été réalisée à l'aide du contraste à gradient de phase (PGC) unique, spécialement conçu pour les plaques multipuits remplies de liquides afin de garantir une qualité d'image optimale du puits complet non perturbé par un ménisque liquide. Les images ont été acquises à un grossissement de 10× à l'aide de l'objectif 5× / 2× (NA 0,35).
Pour une analyse d'image ultérieure et automatique, les données d'image des points temporels individuels par puits ont été concaténées.
Plusieurs solutions d'analyse d'images prêtes à l'emploi pour les analyses courantes sont disponibles avec ZEISS Celldiscoverer 7 pour automatiser l'analyse des données et personnaliser la présentation des résultats avec des tableaux de mesure interactifs, des cartes thermiques et des tracés. Ces modules ZEN BioApp sont disponibles pour fournir des flux de travail d'analyse d'images automatisés simples et personnalisés pour :
• Comptage de cellules
• Quantification de la confluence cellulaire
• Quantification de l'expression génétique
• Détection de points
Les données d'imagerie des plaques ont été analysées à l'aide du module ZEN « Confluence » pour identifier et segmenter automatiquement les cellules et mesurer la surface couverte et le pourcentage de surface. Les applications abordées par ce module comprennent les tests de confluence cellulaire comme mesure de contrôle de la qualité dans les tests basés sur les cellules ainsi que les tests de cicatrisation des plaies pour suivre la migration cellulaire et l'interaction cellule-cellule. La figure 4 montre les résultats d'analyse de l'une de ces plaques.
Figure 4 : Résultats d'une plaque d'une expérience en accéléré. En haut à gauche : résultats de segmentation (module ZEN Confluence). En bas à gauche : disposition de la plaque et affichage de la carte thermique de la confluence des cellules pour le premier point temporel (% de couverture de la zone). À droite : Courbes de croissance des puits individuels (disposition telle qu'indiquée dans la représentation). En bas à droite : Agrandissements de la courbe de croissance des puits F2 à F5 (x : point temporel (h), y : confluence (%))
Lorsque vous regardez les résultats individuels par puits dans un format de carte thermique pour le premier point temporel, la différence de densité est codée par couleur. Alors que certains puits ont commencé avec un nombre relativement faible de cellules indiquées en bleu, d'autres étaient déjà complètement envahis (100 % de confluence, code couleur rouge). Les courbes de croissance individuelles par puits montrent une croissance cellulaire constante au fil du temps pour certains puits. Élargissez vos options d'automatisation pour les applications avancées du ZEISS Celldiscoverer 7 Certaines applications peuvent nécessiter une interaction automatique avec plusieurs échantillons à un moment précis ou de manière régulière, par exemple en ajoutant ou en échangeant des liquides. Cela comprend des analyses cellulaires complexes, des études du rythme circadien, de la biologie du développement sur de longues périodes, des recherches sur des composés ou des procédures de coloration répétitives. Dans un tel cas, le ZEISS Celldiscoverer 7 avec la solution de chargement de plaques automatisé de PAA peut être étendu à un dispositif de manipulation de liquides. Grâce à la flexibilité du gestionnaire d'essais, plusieurs appareils sont déjà intégrés et prêts à l'emploi.
À l'avenir, la flexibilité du logiciel de contrôle PAA S-RUN permettra de concevoir et de développer des systèmes plus grands pour étendre les capacités d'analyse.
Une application fréquemment demandée consiste à ajouter un système de manipulation de liquide à la configuration pour permettre le dosage des composés des plaques cellulaires afin de déterminer les changements de viabilité cellulaire.
Le schéma ci-dessous montre un système client proposé dans lequel un manipulateur de liquide et un carrousel de matériel de laboratoire sont inclus pour permettre à la fois le dosage des cellules et la maintenance des cellules pendant de longs cycles d'incubation avec plusieurs lectures sur ZEISS Celldiscoverer 7 pour permettre d'ajuster les analyses en fonction des données d'imagerie.
PAA travaille avec tous les principaux fournisseurs de manipulateurs de liquides et peut intégrer le choix du client en matière de manipulateur de liquides sur le système pour permettre à l'utilisateur de sélectionner le meilleur instrument pour le processus.
La cellule de travail peut inclure un flux descendant filtré HEPA pour protéger les cellules pendant leur traitement. PAA propose le seul système de flux d'air laminaire sur toute la plate-forme pour assurer une protection ultime des échantillons. Des turbines centrifuges entièrement contrôlées sont utilisées pour fournir un flux descendant uniforme sur toute l'instrumentation et sur toute la plate-forme. Des capteurs sur les portes augmentent le flux d'air au-dessus de la porte pour protéger l'environnement interne de la contamination lorsque la porte est ouverte pour permettre à un opérateur d'accéder en toute sécurité à l'instrumentation interne sans craindre d'introduire une contamination.
PAA fournit également des surfaces antimicrobiennes sur les bancs du système pour éliminer davantage les sources potentielles de contamination et toutes les surfaces où les liquides sont manipulés sont isolées pour contenir les déversements avec des capteurs pour alerter l'opérateur en cas de déversement de liquide dans le système. Le système d'alarme de confinement est entièrement intégré au logiciel de contrôle S-RUN pour permettre de mettre en pause une exécution et d'alerter l'opérateur en cas de problème afin de permettre de résoudre rapidement les problèmes et de poursuivre le processus.
L'avenir
Le moteur de planification révolutionnaire Millipede contenu dans S-RUN utilise l'intelligence artificielle pour surveiller les temps de traitement des procédures répétées afin d'optimiser l'algorithme de planification et de trouver la meilleure solution pour augmenter la vitesse du processus et le débit des échantillons.
Résumé
L'automatisation ne commence pas seulement au niveau du système d'imagerie et ne s'arrête pas non plus après l'acquisition des images. Avec l'intégration de la solution automatisée PAA, ZEISS Celldiscoverer 7 bénéficie d'une amélioration considérable des performances d'automatisation. Les expériences très complexes et à lots multiples peuvent être exécutées automatiquement. La combinaison unique de l'imagerie à champ large et confocale (même avec Airyscan 2) ajoute une autre dimension à l'acquisition automatisée de données 3D et à la manipulation d'échantillons.
Des flux de travail complets et automatisés peuvent être réalisés à l'aide de l'acquisition guidée, de ZEN Connect, des options d'analyse ZEN, ainsi que des options APEER ou tierces.
La configuration proposée pour automatiser l'imagerie des cellules vivantes augmente considérablement le débit d'échantillons, la lecture des données et l'utilisation du système, ce qui permet d'obtenir des résultats plus rapidement, d'augmenter les statistiques et d'obtenir des données fiables, quel que soit le nombre d'utilisateurs du système. Un maximum d'automatisation dans tous les aspects est souhaitable pour de nombreux chercheurs. La complexité croissante de leurs expériences et de leurs résultats exige plus de simplicité en matière d'instrumentation. Ainsi, ils n'ont pas besoin de penser à l'exécution de l'expérience et peuvent tout laisser à l'appareil d'imagerie.
De plus, la facilité d'utilisation de l'automatisation minimise les erreurs coûteuses. ZEISS Celldiscoverer 7 avec la solution de manipulation automatisée des plaques de PAA est désormais prêt à répondre aux exigences de ce domaine d'application.
Les installations d'imagerie bénéficient notamment du rendement global du système et de sa simplicité d'utilisation, ce qui réduit l'interaction manuelle au niveau du système pour les tâches hautement répétitives. Les systèmes peuvent fonctionner à pleine capacité 24 heures sur 24, 7 jours sur 7.
Avec des normes de plus en plus élevées en matière de documentation et de reproductibilité, des projets de recherche toujours plus interdisciplinaires et des contrats de recherche à court terme, l'automatisation s'étend également aux petits laboratoires. Avec ZEISS Celldiscoverer 7, les chercheurs bénéficient en particulier d'un débit d'échantillons élevé et d'une flexibilité couvrant plusieurs modalités d'imagerie ainsi que d'une reproductibilité des données garantie grâce au haut degré d'automatisation.
La solution automatisée ZEISS Celldiscoverer 7 tient ainsi compte des besoins éventuels en termes de débit, de valeur ajoutée, de facilité d'utilisation et de flexibilité de vos recherches.
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